摘 要：目的 运用网络药理学研究方法，分析柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压作用网络与潜在机制。方法 借助TCMSP、TCMID、Stitch等数据库获取柴胡龙骨牡蛎汤的化学成分及对应靶点，PubMed、CTD、TTD、OMIM、DrugBank等数据库检索原发性高血压的疾病靶点；对药物与疾病靶点相映射得柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压的作用靶点，运用Cytoscape和STRING软件构建“化合物-靶点”作用网络与蛋白相互作用（PPI）网络，筛选发挥治疗作用的关键成分与关键靶点，对关键靶点进行GO和pathway富集分析获知其潜在作用机制。结果 预测得到柴胡龙骨牡蛎汤作用于原发性高血压的有效成分137个，靶点168个，关键成分有槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇4个，关键靶点有IL6、AKT1、MAPK8等12个，GO和pathway分析结果显示，柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压与AP-1家族转录因子的激活、白细胞介素-10信号、白细胞介素-4信号和白细胞介素-13信号、细胞凋亡的内在途径、MAPK靶向/由MAP激酶介导的核事件等通路有关。结论 柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压是通过上述潜在的“多成分-多靶点-多途径”来发挥作用的，该研究为柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压物质基础及作用机制的进一步研究奠定基础。
高血压是一种病因多样、复杂，病程逐渐进展、变化的疾病，严重影响血管功能与结构，可导致心、脑、肾的并发症，是慢性病中发病率较高，也是导致动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的最主要的危险因素[1]。它分为2种类型：原发性高血压和继发性高血压，其中原发性高血压的发病率占整个高血压人群的90%以上；且随着社会生活方式和环境的改变，原发性高血压发病率和死亡率呈现上升趋势，因此，高血压防治刻不容缓[2-4]。
中医古籍无原发性高血压相应的病名与记载，属于“中风”“眩晕”“郁证”等范畴，病因多为七情所伤、饮食失节、劳逸失调、内伤虚损；常见的中医证型为肝阳上亢、阴虚阳亢、痰湿壅盛、肝肾阴虚、阴阳两虚、肝火亢盛等，其治疗原则多为平肝潜阳、祛痰通络、清热泻火等[5-7]。柴胡龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》，由柴胡、黄芩、生姜、人参、半夏、大枣、桂枝、大黄、茯苓、牡蛎、龙骨、铅丹组成，诸药合用，共奏疏肝解郁、和解少阳、利胆和胃、通阳泄热、重镇安神之功[8]。古今文献与研究表明柴胡龙骨牡蛎汤具有滋阴潜阳的功效，临床对于原发性高血压的治疗效果显著，能有效降低血压，改善患者的临床症状[8-14]。网络药理学以其整体性和系统性且兼顾相互作用的特点，与中医药的整体观、辨证论治、组方潜药契合度较高[15-16]。据此，本研究拟用网络药理学方法，探讨柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压的作用网络与潜在机制，为经方柴胡龙骨牡蛎汤临床精准定位研究提供药理学依据。
1 材料与方法
1.1 柴胡龙骨牡蛎汤活性成分的获取及靶点筛选
利用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中医药综合数据库（TCMID，http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx）收集柴胡龙骨牡蛎汤中柴胡、黄芩、生姜、人参、半夏、大枣、桂枝、大黄、茯苓、牡蛎、龙骨的化学成分，基于口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18进行筛选，同时结合文献报道对筛选后的成分进行补充，最终确定其活性成分。通过TCMSP、SWISS（http://www. swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http://stitch. embl.de/）、CHEMBL（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）数据库[15-17]查询活性成分相对应的靶标蛋白，并利用Unitprot数据库（http://www.Unitprot.org/）查询靶标蛋白对应的基因名称，剔除非人类的靶点蛋白，最终确定柴胡龙骨牡蛎汤的活性成分及其对应靶点。因铅丹有蓄积中毒的可能，临床上已较少应用，现代临床应用柴胡龙骨牡蛎汤时多去铅丹，用远志、生铁落、磁石等代替[8-14,18-23]，因此本研究未将铅丹纳入研究。
1.2 原发性高血压靶点筛选
在PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）、CTD（http://ctdbase.org/）、TTD（http://db. idrblab.net/ttd/）OMIM（https://www.omim.org/）、数据库中输入关键词“essential hypertension”，收集原发性高血压的相关靶标，在DrugBank（https:// www.drugbank.ca/）数据库中输入治疗高血压的一线药物获取所对应的靶标，将所得靶标取并集筛选重复项后得到原发性高血压的相关靶标信息。
1.3 网络构建与分析
将所得化合物的预测靶点与高血压的相关靶点进行映射，即两者取交集，得到柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的预测靶点，利用Cytoscape软件构建柴胡龙骨牡蛎汤候选化合物作用靶点网络并对其进行分析，按照靶点数多少排名，筛选出柴胡龙骨牡蛎汤作用于高血压的有效成分。将交集得到的靶点导入String数据库（http://stringdb.org/），构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并用Cytoscape软件对所得的PPI网络数据进行分析，通过Cytoscape中的Cyto NCA插件，借助度中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和局部边连通性（LAC）指标进行筛选，首先筛选大于2倍中位数的DC值的节点，筛选完成后继续筛选大于每个指标所对应的中位数的节点，得到柴胡龙骨牡蛎汤作用于高血压的关键靶点。关键靶点对应成分作图，根据度（degree）值筛选，结合前面选取的靶点数较多的成分，得到柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的关键成分。对筛选得到的高血压相关靶点利用String软件构建PPI网络，PPI网络分析与靶点筛选同上，对比柴胡龙骨牡蛎汤作用于高血压的关键靶点，看其是否在筛选得到的高血压主要靶点内。
1.4 GO和pathway分析
利用Cytoscape中的ClueGo插件对柴胡龙骨牡蛎汤作用于高血压的预测靶点进行GO分析和通路分析。
1.5 柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压的成分及机制的文献验证
通过检索国内外文献，挖掘分析柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压的相关成分与机制，为网络药理学所预测的结果提供文献验证。
2 结果
2.1 活性成分筛选及靶点筛选
通过TCMSP数据库及文献查找收集到柴胡龙骨牡蛎汤的化合物基本信息，以OB≥30%和DL≥0.18筛选，剔除掉未找到靶点的化学成分，得到活性化合物152个，其中柴胡18个、黄芩33个、人参23个、半夏12个、生姜7个、大枣26个、桂枝9个、茯苓9个、大黄12个、牡蛎2个、龙骨1个；预测靶标共3 258个，见表1。将预测靶标综合筛选保留唯一值，得到709个预测药物靶点。
2.2 疾病靶点筛选结果
利用PubMed、CTD、TTD、DrugBank、OMIM数据库检索高血压所得结果进行综合，删除重复项，得到高血压相关靶点640个。
2.3 网络构建与结果分析
将所得到的柴胡龙骨牡蛎汤的药物靶点与高血压相关靶点进行映射，得到168个共有靶点，对应柴胡龙骨牡蛎汤活性成分137个，利用Cytoscape软件构建的化合物-靶点网络见图1。靶点数排前8位的成分为槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、山柰酚（kaempferol）、碳酸钙（calcium carbonate）、柴胡皂苷d（saikosaponin d）、8-姜酚（8-gingerol）、20 (R)-人参皂苷Rg2［20 (R)-ginsenoside Rg2］，见表2，这些可能为柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的有效成分。将映射所得的168个靶点利用String作PPI网络，其产生相互作用的网络有168个节点，2 496条边，借助指标筛选完成后，得到靶点12的网络，如图2所示，将这12个靶点对应成分进行网络构建得到图3所示网络，按照度值筛选前8位的成分为槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、山柰酚、汉黄芩素、豆甾醇、芦荟大黄素、β-胡萝卜素，与前面所得到的靶点数排名前8位的成分取交集，得到槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚，提示这4个成分可能为柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的关键成分。将得到的高血压相关靶点构建PPI网络，筛选得到高血压的主要靶点，网络节点42，边数796，见图4。上面所得到的12个靶点均包含在高血压主要靶点内，表明这12个靶点可能为柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的关键靶点。
2.4 生物过程和通路富集分析
利用Cytoscape中的ClueGO插件对柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的12个关键靶点进行GO分析，见图5，结果显示柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压主要与神经炎症反应（neuroinflammatory response）、平滑肌细胞增殖阳性调节（positive regulation of smooth muscle cell proliferation）、细胞对镉离子的反应（cellular response tocadmium ion）等过程密切相关，其参与的基因见表3。对其进行通路分析，结果见图6。参与的通路主要有AP-1家族转录因子的激活（activation of the AP-1family of transcription factors）、白细胞介素-10信号（interleukin-10signaling）、白细胞介素-4信号和白细胞介素-13信号（interleukin-4 and interleukin-13signaling）、细胞凋亡的内在途径（intrinsicpathway for apoptosis）、MAPK靶向/由MAP激酶介导的核事件（MAPKtargets/nuclear events mediated by MAP kinases）等，涉及的相关基因见表4。
2.5 柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压的成分及机制的文献验证
通过文献挖掘与分析，总结柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的成分及其作用机制，见图7。原发性高血压病中医病机以肾虚为本,其病位及变化在肝,与心密切相关，中医证型分布以肝阳上亢、肝肾阴虚、痰湿壅盛型为主，柴胡龙骨牡蛎汤可疏肝解郁、和解少阳、利胆和胃、通阳泄热、重镇安神，遵循辨证论治的原则，故临床应用此方治疗原发性高血压效果显著。大量研究已表明槲皮素、植物甾醇、人参皂苷Rg2、Rg1、Rb1可预防和治疗高血压[24-28]；山柰酚可改善胰岛素抵制[29-30]；黄芩苷元可调节环磷腺苷水平而产生降压作用；牡蛎中的牡蛎多糖可提高锌、镉比例, 有利于改善患者高血压症状[31-33]。其治疗高血压的机制主要与改善血管内皮功能及调控炎症介质、抑制MMP的表达量等方面，明晰柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压可能与调控炎症、细胞凋亡内在途径以及MAPK通路有关。
3 讨论
本研究运用网络药理学研究模式，探讨了柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压的作用网络与潜在机制，研究显示，柴胡龙骨牡蛎汤治疗高血压的可能关键成分4个，为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚，关键靶点12个，为JUN、MAPK1、CXCL8、PTGS2、IL1B、AKT1、MAPK8、MMP9、VEGFA、TNF、IL6、TP53，进一步对其进行GO分析和pathway分析，主要通路为AP-1家族转录因子的激活、白细胞介素-10信号，白细胞介素-4信号和白细胞介素-13信号、细胞凋亡的内在途径等。
有文献研究表明高血压是心血管系统疾病的主要危险因素，发病机制主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）、调节和控制体内血脂、抑制交感神经活动、改善胰岛素抵抗、改善血管内皮功能等有关[34]，且炎症因子与原发性高血压的发生发展关系密切，炎性细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子等，DNA低甲基化与外周血炎症因子IL6水平升高导致内皮细胞功能障碍，进而影响原发性高血压的发生发展，IL6启动子Cp G2-3位点甲基化水平与血压呈负相关，随着DNA甲基化水平的降低血压呈升高趋势，IL6的Cp G3位点的低甲基化是原发性高血压的危险因素[35]，IL6与原发性高血压具有独特相关性，它可引起血管收缩、与血管紧张素II相互作用等多种途径引起血压升高；IL4与原发性高血压形成恶性循环，血压升高导致血管痉挛收缩，血管内皮重塑，IL4分泌增多，而IL4能促进血管平滑肌细胞增殖，促进脂蛋白代谢，促进高血压的发展进程；研究显示高血压患者血清中的CXCL8（IL8）较高，经抗炎治疗后明显降低，结果表明IL8与原发性高血压的发生关系密切；IL10作为抗炎因子，可以减轻炎症反应和损伤，对血管内皮和心脏具有一定保护作用，IL1B与高血压的分级呈现正相关，刺激并增殖血管平滑肌细胞，改善细胞膜上的Ca2+渗透性，血管收缩，从而导致血压升高。TNF也与原发性高血压相互作用，同时高血压患者也存在MMP9代谢异常[36-38]。JUN是AP-1（激活蛋白-1）家族的一成员，AP-1可调控心肌肥厚相关基因的早期应答，在调控高血压心室肥厚中有着重要作用[39]，同时AP-1可预防和改善老年高血压的动脉僵硬度[40]，研究发现miR-31a-5p和TP53是候选miRNA和调节高血压的基因，TP53是miR-31a-5p的虚拟目标基因，miR-31a-5p通过动脉平滑肌细胞的加速增殖和通过靶向TP53抑制细胞凋亡而参与高血压[41]。血管内皮生长因子（VEGFA）与血压升高呈正相关，提示VGEFA与血管损伤、动脉粥样硬化密切相关，有望成为预测和治疗高血压的重要指标[42]。MAPK1、AKT1属于与血管内皮障碍相关的基因，同时MAPK8、MAPK1参与了MAPK信号通路，与高血压的发生密切相关[43-44]。PTGS2与血小板和内皮细胞上的G蛋白耦合，激活G蛋白，细胞内的cAMP水平升高，cAMP激活蛋白激酶A，血小板聚集抑制，血管平滑肌松弛，与高血压有一定联系[45]。
本研究运用网络药理学技术对柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压进行了系统分析，初步揭示了柴胡龙骨牡蛎汤治疗原发性高血压潜在的活性成分、作用网络和潜在作用机制，为进一步探讨其发挥作用的药效物质基础和作用机制研究提供方向，其后续尚需系统的靶点验证和体内外实验证实其功效网络的内在关联和作用靶点集合。